遮天,梦入神机

醫(yī)學魔改大師玩跨界，CRISPR遇見分子診斷

發(fā)布時間：2022-01-19

引言

2020年，瑞典皇家科學院將諾貝爾化學獎授予Jennifer Doudna教授Emmanuelle Charpentier博士以表彰她們在CRISPR/Cas9基因編輯方法上所做出的貢獻。得益于此，基因療法隨之大放異彩，在很短的時間內(nèi)完成了由基礎理論到初步科學驗證，再到實際應用的快速發(fā)展。但這一科學技術卻也一直伴隨著爭議的聲音，給人無限遐想的同時，也帶來一些隱憂。瑕不掩瑜，這些暫時的爭議阻擋不了人類對于這一充滿潛力的新技術擴展應用的嘗試。近年來，以基因編輯而聞名的生物技術正被用于開發(fā)便攜式、家庭式的傳染病和癌癥測試等分子診斷領域。CRISPR/Cas的神秘面紗正在被緩緩揭開。

安永生命科學與醫(yī)療健康行業(yè)課題組對話專家，帶你走近：CRISPR/Cas基因編輯遇見分子診斷。

專家介紹

張明東博士

現(xiàn)任波士頓科學亞太區(qū)首席醫(yī)務官及醫(yī)學事務和衛(wèi)生經(jīng)濟副總裁

前美國食品藥政管理局醫(yī)務官和流行病學家

曾任職香港中文大學醫(yī)學院教授

美國國立衛(wèi)生研究院國立癌癥研究所博士后

美國貝樂醫(yī)學院分子病毒學博士

“CRISPR/Cas技術是一種逆天改命的手段，讓人產(chǎn)生很多瑰麗和美好的遐想。”

王弢博士

中國抗癌協(xié)會腫瘤標志專業(yè)委員ctDNA技術專家委員會副組長

江蘇省腫瘤分子診斷工程技術研究中心主任

蘇州大學（特聘-產(chǎn)業(yè)方向）教授

復旦大學醫(yī)學博士

“CRISPR的應用，起步于醫(yī)學，終將不止于醫(yī)學。”

對話專家

CRISPR/Cas一直存在爭議，您建議安永公眾號的讀者如何正確理解這一技術？

張明東：

CRISPR是原核生物基因組內(nèi)的一段重復序列。Cas基因則位于CRISPR基因附近，或散布于基因組其他地方，該基因編碼的蛋白均可與CRISPR序列區(qū)域共同發(fā)生作用。因此，該基因被叫做CRISPR關聯(lián)基因，即Cas。

生命進化史上，某些細菌為了將入侵的病毒基因清除，進化出CRISPR/Cas基因剪切防御系統(tǒng)，能夠在遭到病毒入侵后，把病毒基因的一小段存儲到自身 DNA 里稱為 CRISPR 的存儲空間中。這樣，當病毒再次入侵時，細菌便可以根據(jù)存儲的片段識別病毒，并將病毒的DNA切斷達到抑制作用。這一機制真正體現(xiàn)了生命之間的微妙平衡，相生相克又不斷進化。

CRISPR/Cas技術的發(fā)明，為臨床醫(yī)學提供了超越以往的工具。原本不可治愈的疾病有了治愈的可能，比如基因變異導致的各類型遺傳疾病、HIV等難以根治的病毒感染，糖尿病易感性人群的基因改造等，甚至還有可能成為更有效的癌癥治療手段。不夸張地說，CRISPR/Cas技術可以被稱為是一種逆天改命的手段，讓人產(chǎn)生很多瑰麗和美好的遐想。

然而，重大的科技發(fā)現(xiàn)常常伴有不容忽視的兩面性?；鹚幍陌l(fā)明，不僅帶來礦產(chǎn)開發(fā)、道路建設等生產(chǎn)力的提升，也招致槍械帶來的巨大人員傷亡；20世紀最偉大的發(fā)現(xiàn)“相對論”，開啟了高效、清潔的核能應用，卻也讓人們籠罩在原子彈的陰霾之下。對CRISPR基因編輯技術來說，它使科學家擁有改造人類疾病基因或消滅生物的能力，也帶來不受倫理管控下生物武器泛濫甚至畸形生物變異的可能性。這一技術發(fā)明無疑是人類自火器時代到核能時代以來所面臨的最嚴峻挑戰(zhàn)。

王弢：

CRISPR技術開啟了基因編輯的大幕！這是一項了解生命本質(zhì)、挽救生命甚至創(chuàng)造生命的革命性技術，期待在全球科學技術人員的不懈努力下，發(fā)揮它最大的價值，逐步實現(xiàn)讓人類遠離眾多疾病折磨，實現(xiàn)更健康和更長壽生活的更多應用。2020年新冠疫情突然爆發(fā)，恰此時mRNA疫苗大獲成功，mRNA治療藥物獲得快速發(fā)展。突破性的生物技術不斷涌現(xiàn)，“21世紀是生物技術時代”的預言正在成為現(xiàn)實?！?/p>

誠如明東博士所言，作為這個時代光彩奪目明珠的CRISPR有兩面性，如何防范這個魔法無窮的工具不被惡意群體肆意濫用，是人類大家庭必須直面的共同課題。我始終相信，每一次技術突破的洗禮，帶給人類的不僅是生產(chǎn)力的巨大提升，更是人類不斷認知自然和自身的過程，相信在CRIPSR等生物技術的加持下，人類將會擁有更美好的家園。

對于11月12日《Nature Communication》上發(fā)表的關于CRISPR/Cas9基因編輯或許會讓細胞產(chǎn)生與癌癥相關的基因突變形式，您覺得對產(chǎn)業(yè)界的影響是什么？

張明東：

CRISPR技術自問世以來，就獲得“基因魔剪”的稱號，在醫(yī)學科研領域可以說是百花齊放、碩果累累，同時在農(nóng)業(yè)、環(huán)境等領域也展現(xiàn)了光明的前景。2020年發(fā)現(xiàn)CRISPR/Cas技術的科學家Jennifer Doudna教授和Emmanuelle Charpentier博士榮獲諾貝爾化學獎，這是諾貝爾獎歷史上少見的從發(fā)現(xiàn)到獲獎僅數(shù)年的現(xiàn)象，也說明這是一項多么重要的發(fā)現(xiàn)。

近期，數(shù)篇Nature子刊文章提示，CRISPR會在體內(nèi)引起不可預測的的脫靶效應，甚至癌癥相關的突變。因而，CRISPR技術到底是“魔剪”還是“亂剪”，一時眾說紛紜。從CRIPSR技術偏靶造成的異常突變而言，這只是這項革命性技術在應用中的一個插曲，說明現(xiàn)在的CRISPR編輯技術還不夠精準，還需要更多優(yōu)化。需要進一步優(yōu)化到單堿基編輯，優(yōu)化到特定部位的單堿基編輯，實現(xiàn)更精細精確的基因編輯操作。所以我想，大家不要因為目前CRISPR技術有一些瑕疵，就下結論說它多么不堪或者多么危險。這些瑕疵是完全可以克服的，只是時間長短的問題。

王弢：

CRISPR技術出現(xiàn)后，作為一項通用的技術，在實際應用的領域或方向必然存在一些瑕疵，這是十分正常的，需要的是科研人員不斷嘗試、不斷改進，逐步實現(xiàn)產(chǎn)業(yè)應用。如果都是一路順風，我想那才是需要每個人擔心的。每個細分方向或具體疾病應用的CRISPR關鍵細節(jié)技術的開發(fā)，需要再多一點時間，我們會看到更多的實際結果，可能許多不可治療的疾病都將變?yōu)榭芍斡募膊?，這一天并不遙遠。總體而言，CRISPR的應用，起步于醫(yī)學，終將不止于醫(yī)學。

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能否談一談CRISPR技術目前較為成熟的醫(yī)學應用領域，在哪些方面為人類帶來福音？

張明東：

目前進展明顯的治療領域，主要包括：

①癌癥治療，主要針對免疫細胞改造，突變細胞的基因修補或切除等，有多個臨床研究，部分獲得積極的結果。

②遺傳疾病，比如亨廷頓氏舞蹈癥病(Huntington ' s disease)、杜氏肌營養(yǎng)不良癥（DMD基因）等已有研究報道，進展到臨床II期及之后也有報道，但還需要公布相關臨床數(shù)據(jù)。

③3HIV等病毒的體內(nèi)整合感染方面的應用，我想這是近期科研人員比較有把握會有重要進展的領域，值得大家關注。

王弢：

在醫(yī)學診斷領域，CRISPR-based核酸檢測技術最有可能成為新一代的分子診斷平臺，尤其在遠離PCR實驗室場景下的應用。

醫(yī)學診斷是現(xiàn)代醫(yī)學發(fā)現(xiàn)疾病的入口，提供了疾病的快速預警和精準診斷，讓治療有針對性的明確目標。數(shù)十年來，核酸檢驗領域，真正得到廣泛應用的技術僅有PCR和NGS，它們當中一個實現(xiàn)了單靶標或少靶標檢驗，一個實現(xiàn)了多靶標并行檢驗。兩者都依賴于大型醫(yī)學檢驗實驗室、專業(yè)操作和大型儀器的應用場景，是一種遠離疾病人群個體和現(xiàn)場的檢驗。

而快速準確診斷感染性疾病應用是目前緊迫的需求，是指導疫情防控，保障公共衛(wèi)生安全，避免大范圍傳播的關鍵。這一點無論是對大型醫(yī)療中心，還是在缺醫(yī)少藥的基層醫(yī)療衛(wèi)生機構，或是欠發(fā)達的國家和地區(qū)都至關重要。理想的診斷方式應該價格低廉、準確性高、快速、操作簡便（無需專業(yè)人士操作）以及無需專業(yè)設備和基礎設施要求。

從我個人的意見以及我們的實踐來看，CRIPSR-based核酸檢測技術是第一個能真正實現(xiàn)精確、現(xiàn)場甚至居家自測的醫(yī)學應用級診斷平臺。

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如何認識CRISPR-based診斷技術，它有哪些重要突破？能否談一談該技術目前較為成熟的應用領域，在哪些方面為人類帶來福音？

張明東：

CRISPR/Cas技術以出眾的基因編輯能力聞名于世，但顯然它的技術應用范圍絕不僅限于基因編輯。CRISPR/Cas技術的創(chuàng)立者之一Jennifer Doudna教授早在2017年就將該技術應用于RNA檢測，創(chuàng)辦Mammoth Biosciences公司，利用Cas12a的非特異性ssDNA降解能力開發(fā)出新的核酸快速檢測方法。幾乎同時，CRISPR研究先鋒者之一的華人科學家張鋒教授于2017年創(chuàng)辦Sherlock BioSciences公司，利用Cas13蛋白的天然RNase活性改進，建立了快速核酸檢測SHERLOCKTM（Specific High Sensitivity Enzymatic Reporter unlocking）平臺。

2021年，基于CRISPR檢測平臺被美國《Science》雜志譽為“下一代分子診斷技術”! CRISPR顛覆傳統(tǒng)醫(yī)學：一張紙、幾分鐘，即可診斷疾病！該技術將在病原檢測、疾病篩查、精準醫(yī)療等眾多領域展現(xiàn)巨大的應用潛力。

王弢：

Mammoth Biosciences的“DETECTR BOOST”技術平臺，可在30分鐘內(nèi)獲得診斷結果。Sherlock Biosciences開發(fā)了首個獲美國FDA緊急使用授權的基于CRISPR技術新冠病毒測試，被評為2021年“全球最具創(chuàng)新力10大生物技術公司”之一。

在國內(nèi)，有多家生物技術公司參與開發(fā)了CRISPR-based核酸檢測技術的新冠病毒診斷產(chǎn)品，主要還是集中于醫(yī)學實驗室場景下的操作。為真生物開發(fā)了恒溫擴增+CRISPR聯(lián)合應用的小型化單人份裝置，首次實現(xiàn)基于CRISPR新冠病毒核酸的單人自測或現(xiàn)場快檢，除應用于國內(nèi)渠道外，也在積極申報美國FDA緊急使用授權（EUA）。

CRISPR-based快速檢測可實現(xiàn)各類微生物的居家自測或現(xiàn)場檢驗，類似于現(xiàn)在家用的血糖監(jiān)測。我想，在不遠的將來，一種全新的醫(yī)療形態(tài)將會逐步呈現(xiàn)。

張明東：

目前CRISPR-based核酸檢測技術具有明顯的高靈敏度和高特異性的優(yōu)勢，已實現(xiàn)1copy/μL檢測，甚至高于常規(guī)的熒光PCR，在病原體檢測如SARS-CoV-2檢測方面已實現(xiàn)臨床應用。

應用上面，新CRISPR測試能夠節(jié)省時間和金錢，甚至不再需要去看醫(yī)生就能做出診斷。這種診斷可以在幾分鐘內(nèi)得出明確的陽性或陰性結果，類似于家庭懷孕自測。測試結果可以通過手機上的應用程序發(fā)送給醫(yī)生，醫(yī)生可以立即開出處方或給出治療建議。這些測試還可以在醫(yī)院使用，以快速確定感染病原體，以及引起腫瘤的突變基因，或者快速預測人們是否有罹患某種疾病的遺傳基因。

相比qPCR技術，CRISPR核酸檢測技術主要有哪些優(yōu)勢？CRISPR核酸檢測技術產(chǎn)業(yè)化尚需解決的核心問題有哪些？從國外的技術和臨床試驗對比來看，國內(nèi)CRISPR核酸檢測技術正處于怎樣的發(fā)展階段？

王弢：

相比qPCR，CRSIPR核酸檢測技術擁有獨特優(yōu)勢：

①復雜背景下的高靈敏度，可對aM（10-18M）濃度的靶核酸分子進行高效檢測；而qPCR技術很難實現(xiàn)復雜背景下靶分子的有效擴增。

②復雜背景下的高特異性。CRISPR核酸檢測技術具有極為優(yōu)異的抗干擾性能，可實現(xiàn)對單堿基異常的精確監(jiān)測；qPCR影響因素多，抗干擾能力差，難以避免假陽的存在。

③更為簡易的操作，無需依賴較大的儀器，10-60分鐘內(nèi)完成擴增全程；qPCR依賴多步驟的復雜操作，嚴格環(huán)境控制，耗時1-3小時，需要復雜的大型精密儀器。

張明東：

CRISPR核酸檢測技術具有高靈敏度、高特異性和極為顯著的抗干擾等優(yōu)勢，但如何實現(xiàn)核酸預擴增和CRISPR一體化反應是一個難題，以及如何實現(xiàn)單人份或高通量快速檢測也是不同場景下應用的需要，還有各種關鍵生物酶的產(chǎn)業(yè)化是需要解決的核心問題。

王弢：

國內(nèi)CRISPR核酸檢測技術的發(fā)展處于快速發(fā)展的起步階段，整個產(chǎn)業(yè)鏈還不是很成熟。成熟的CRISPR核酸檢測技術如果應用于院外場景，需做到：

①快速，通常1小時內(nèi)完成檢測。

②防污染，全封閉操作。

③高性能，靈敏度和特異性高于或等同于qPCR。

④便捷，各檢測試劑All in于一管。

⑤常溫儲運。

結束語

基因組中的微小改變，會帶來有機體的巨大變化。隨著科研人員對生命系統(tǒng)的研究不斷深入和資本市場的強力支持，我們有理由相信，在不遠的將來，我們將會看到CRISPR/Cas更加廣泛、成熟地運用于臨床，有效治療各種遺傳疾病。但值得警惕的是，這項革命性的技術也是一把雙刃劍，只有完善相關法律法規(guī)，厘清科技與倫理的邊界，規(guī)范科研行為，才能引導基因編輯領域的健康發(fā)展。

參考資料

近日，一篇發(fā)表在國際雜志Nature Communications上題為“A systematic genome-wide mapping of oncogenic mutation selection during CRISPR-Cas9 genome editing”的研究報告中，來自美國國立衛(wèi)生研究院等機構的科學家們通過研究發(fā)現(xiàn)，基于CRISPR/Cas的基因編輯（尤其是基因敲除）或許會讓正常細胞產(chǎn)生與癌癥相關的基因突變形式，“基因剪刀”再引爭議。

本文中的觀點僅代表受訪者個人觀點，并不一定反映安永全球機構或其成員機構的觀點。

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